PENGUKURAN KONSENTRASI DNA

A. TUJUAN Mahasiswa dapat melakukan pengukuran konsentrasi DNA dengan menggunakan spektrofotometer. B. DASAR TEORI Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA (deoxyribonucleid acid) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Tetapi ada pula DNA yang terdapat di mitokondria, oleh karena itu disebut DNA mitokondria. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik. Artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktifitas sel. Dan ini berlaku umum bagi setiap organisme (Anonim, 2011). Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan

kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011). Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible), spektrofotometri UV (ultra violet), Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet – visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi, 2009). Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi, 2009). Pada praktikum kali ini digunakan spektrofotometri UV-VIS. Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang

Sehingga kemurnian DNA dapat dukur dengan menghitung nilai absorbansi  260 nm dibagi dengan nilai absorbansi  280 (Å260/Å280). dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1. sedang kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada  280 nm. apabila kurang dari nilai tersebut maka dilakukan pemurnian ulang. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis. Oleh karena itu. sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. DNA hasil isolasi yang baik mempunyai tingkat kemurnian minimal 1. Rumus perhitungan konsentrasi DNA adalah sebagai berikut: Abs 260nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA C. maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna (Riyadi. DNA murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin. 2011) Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis.0. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada  260 nm. yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat. Untuk sistem spektrofotometri.8-2. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita. ALAT & BAHAN . Bening dan transparan. Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda.gelombang 190-380 nm.7. sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna.

 Alat 1. Kuvet 3. Menentukan konsentrasi protein: Masukkan larutan DNA 10 µl ke dalam cuvet yang telah berisi 1 ml aquades. Lakukan pembacaan spektrofotometer seprti paba penentusn konsentrasi blanko. DNA – Abs 260 nm air X 40µg Jumlah larutan DNA plasmid (µl) Menentukan kemurnian DNA: Hitung dengan menggunakan rumus: Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA . Isolat DNA 2. Hitung jumlah DNA dengan asumsi 1 Abs260nm = 40µg DNA Rumus : ( Abs 260nm Lar. Aquadest D. kemudian campur dengan baik. ulangi langkah diatas untuk semua sampel larutan DNA. Speltrofotometer UV-VIS 2. Mikropipet  Bahan 1. PROSEDUR Menentukan konsentrasi blangko: Masukkan 1 ml akuades ke dalam kuvet spektrofotometer untuk mengukur dengan sinar UV. lalu lakukan pembacaan pada panjang gelombang (λ) 260nm dan 280 nm.

019 0.028 Kelompok 1 2 3 4 5 6 Sift Jumat Absorbansi λ 260 nm 0. HASIL PENGAMATAN Pengukuran konsentrasi DNA Abs Blangko (aquadest): λ260 nm = -0.003 0.011 0.001 λ280 nm = 0.055 0.078 0.005 0.000 Sift Senin Absorbansi λ 260 nm 0.007 0.041 0.028 0.015 0.078 0.035 - Kelompok 1 2 3 4 5 6 .045 λ 280 nm 0.018 0.091 0.121 0.012 0.032 λ 280 nm 0.E.084 0.

078– (-0.116 µg/ µl ( Abs 260nm Lar.001) 10 µl 0.001) 10 µl 0. Untuk itu data kelompok 2 sampai 5 yaitu sebagai berikut: Kelompok 2: Konsentrasi DNA = ( Abs 260nm Lar.F. DNA – Abs 260 nm air ) Jumlah larutan DNA plasmid (µl) 0. DNA – Abs 260 nm air ) Konsentrasi DNA = Jumlah larutan DNA plasmid (µl) X 40µg = 0. Pada kelompok 1 dan 6 tidak didapatkan data absorbansi karena sampel larutan DNA tidak mencukupi karena telah digunakan untuk melaksanakan percobaan pemotongan DNA.029 10 µl X 40µg X 40µg X 40µg = = = Kelompok 3: 0.316 µg/ µl .079 10 µl X 40µg X 40µg = = 0. PEMBAHASAN Pada praktikum pengukuran DNA pada Sift Jumat didapatkan konsentrasi masinh-masing kelompok.028– (-0.

132 µg/ µl Tingkat kemurnian DNA dari masing-masing kelompok yaitu sebagai berikut: Kelompok 2 : Tingkat kemurnian = Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA 0. DNA – Abs 260 nm air ) Jumlah larutan DNA plasmid (µl) 0.001) 10 µl 0.042 10 µl X 40µg X 40µg X 40µg = = = Kelompok 5: Konsentrasi DNA = 0.001) 10 µl 0.168 µg/ µl ( Abs 260nm Lar.474 .041– (-0.032– (-0.028 = 0. DNA – Abs 260 nm air ) X 40µg Jumlah larutan DNA plasmid (µl) = 0.019 = 1.Kelompok 4: Konsentrasi DNA = ( Abs 260nm Lar.033 10 µl X 40µg X 40µg = = 0.

018 = Kelompok 4: Tingkat kemurnian = 4.041 = 0.914 Tingkat kemurnian dari kelompok 2 dan 5 tidak memenuhi syarat kemurnian karena tidak memasuki rentang kemurnian pada 1.334 Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA 0. KESIMPULAN .0.032 = 0. G. Hal ini dapat disebabkan oleh : 1) ketidak telitian praktikan dalam melakukan isolasi DNA 2) Sampel yang digunakan pada saat perhitungan konsentrasi tidak memenuhi volume 10 l.011 = Kelompok 5: Tingkat kemurnian = 3.035 = 0.Kelompok 3: Tingkat kemurnian = Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA 0.8-2.078 = 0.727 Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA 0.

Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas. H. Kelompok 3: 0. Kelompok 4 : 0. 2011. Malang.132 µg/ µl 2. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman Dengan Metode RAPD.8-2.168 µg/ µl .316 µg/ µl . P.com. Tingkat kemurnian dari kelonmpok 2 dan 5 tidak memenuhi syarat kemurnian karena tidak memasuki rentang kemurnian pada 1.Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa: 1. http://puspalarasati. [ Diakses tanggal 30 Mei 2012] .wordpress. Konsentrasi masing-masing sampel DNA adalah Kelompok 2: 0. DAFTAR PUSTAKA Fatchiyah.116 µg/ µl . Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya.0. 2011. Larasati. dan Kelompok 5: 0.