LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA

I. II. III. Nomor Percobaan : V Nama Percobaan : Titrasi Formal Asam Amino

Tujuan Percobaan : Untuk mengetahui titik akhir titrasi antara gugus karboksil dengan NaOH

IV.

Dasar Teori Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup

dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan didalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi; ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. (Lehninger, 1982) Kunci struktur ribuan protein yang berbeda-beda adalah gugus pada molekul unit pembangun protein yang relative sederhana. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masingmasing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. (Lehninger, 1982) Asam amino adalah senyawa dan amina organik yang (biasanya -NH2).

memiliki gugus fungsional karboksil (-COOH)

Dalam biokimia seringkali pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon yang sama (disebut atom C "alfa" atau ). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang paling banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat penting

dalam organisme, yaitu sebagai penyusun protein. 1

Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil (COOH), atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya. Gambar Struktur asam -amino, dengan gugus amina di sebelah kiri dan gugus karboksil di sebelah kanan

Atom C pusat tersebut dinamai atom C ("C-alfa") sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom C ini, senyawa tersebut merupakan asam -amino. Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar. Asam amino dalam bentuk tidak terion (kiri) dan dalam bentuk zwitterion.

Karena asam amino memiliki gugus aktif amina dan karboksil sekaligus, zat ini dapat dianggap sebagai sekaligus asam dan basa (walaupun pH alaminya biasanya dipengaruhi oleh gugus-R yang dimiliki). Pada pH tertentu yang disebut titik isolistrik, gugus amina pada asam amino menjadi bermuatan positif (terprotonasi, NH3+), sedangkan gugus karboksilnya menjadi bermuatan negatif (terdeprotonasi, COO-). Titik isolistrik ini spesifik bergantung pada jenis asam aminonya. Dalam keadaan demikian, asam amino tersebut dikatakan

berbentuk zwitter-ion. Zwitter-ion dapat diekstrak dari larutan asam amino sebagai struktur kristal putih yang bertitik lebur tinggi karena sifat dipolarnya. Kebanyakan asam amino bebas berada dalam bentuk zwitter-ion pada pH netral maupun pH fisiologis yang dekat netral. Menurut Lehninger (1982), Asam amino dapat digolongkan berdasarkan gugus R. Terdapat empat golongan asam amino: (1) golongan dengan gugus R nonpolar atau hidrofobik, (2) golongan dengan gugus R polar, tetapi tidak bermuatan, (3) golongan dengan gugus R bermuatan negatif, dan (4) golongan dengan gugus R bermuatan positif. 1. Golongan dengan gugus R nonpolar atau hidrofobik Gugus R dalam golongan asam amino ini merupakan hidrokarbon, dan bersifat hidrofobik. Meliputi lima asam amino dengan gugus R alifatik (alanin, valin, leusin, isoleusin, dan prolin), dua dengan lingkaran aromatic (fenilalanin dan triptofan), dan satu yang mengandung sulfur (metionin). 2. Golongan dengan gugus R polar tidak bermuatan Gugus R dari asam amino polar lebih larut di dalam air, atau lebih hidrofilik, dibandingkan dengan asam amino nonpolar, karena golongan ini mengandung gugus fungsionil yang membentuk ikatan hydrogen dengan air. Meliputi: glisin, serin, treonin, sistein, tirosin, asparagin, dan glutamine. 3. Golongan dengan gugus R bermuatan negative Mengandung gugus R dengan muatan total negative pada pH 7 adalah asam aspartat dan asam glutamate, masing-masing mempunyai tambahan gugus karboksil. Asam amino ini merupakan senyawa induk asparagin dan glutamine berturut-turut. 4. Golongan dengan gugus R bermuatan positif Asam amino yang mengandung gugus R dengan muatan total positif pada pH 7 adalah lisin, yang mengandung tambahan gugus amino (kedua) pada posisi di rantai alifatiknya; arginin, yang mengandung gugus guanidine bermuatan positif; dan histidin yang mengandung gugus inidazol yang mengion sedikit.

Di dalam larutan, asam amino terionisasi dan dapat bersifat sebagai asam atau basa. Pengetahuan mengenai sifat-sifat asam basa dari asam amino amat penting di dalam pengertian berbagai sifat protein. Tambahan lagi, seni pemisahan, identifikasi, dan kuantifikasi asam amino yang berbeda, yang merupakan tahap penting dalam menentukan komposisi dan urutan asam amino dari molekul protein, didasarkan atas tingkah laku asam-basa yang khas. Asam-asam -amino yang mempunyai gugus amino tunggal dan gugus karboksil tunggal mengkristal dari larutan netral dalam bentuk ion penuh, yang disebut ion dipolar atau zwiterion . Walaupun ion dipolar bersifat netral dan tidak bergerak di dalam medan listrik, ion berlawanan pada kedua ini mempunyai muatan listrik yang

kutubnya. Sifat dipolar asam amino pertama-tama

ditunjukkan oleh kenyataan bahwa kristal asam amino mempunyai titik lebur yang jauh lebih tinggi dari titik didih molekul organic lain yang berukuran sama. Kisi kristal asam amino dipertahankan oleh gaya elektrostatik yang kuat di antara muatan positif dan negative gugus fungsionil molekul sekelilingnya, serupa dengan kisi kristal ion NaCl yang stabil. Suhu yang amat tinggi harus diberikan pada kisi ion tersebut, untuk memisahkan muatan positif dan negative yang salaing berinteraksi secara kuat satu dengan yang lainnya, sehingga kristal dapat melebur. Sebaliknya, kebanyakan senyawa organic nonionic sederhana yang berat molekulnya sama, yang mempunyai titik didih yang relative rendah, sesuai dengan kisi kristal nonioniknya yang relative lunak dan tidak stabil.

Asam Amino Dapat Berperan Sebagai Asam dan Sebagai Basa Jika suatu kristal asam amino, misalnya alanin, dilarutkan di dalam air, molekul ini menjadi ion dipolar, yang dapat berperan sebagai suatu asam (donor proton) atau sebagai basa (akseptor proton) . Senyawa yang mempunyai kedua sifat ini dinyatakan sebagai amfoter dan sering kali disebut sebagai ampolit, singkatan dari amfoteric electrolytes. Asam monoamino monokarboksilat -amino yang sederhana seperti alanin, sebenarnya merupakan asam diprotik dalam keadaan semua molekul mengikat proton, yaitu jika gugus karboksil dan gugus amino telah mengikat

proton. Dalam bentuk ini, asam amino mempunyai dua gugus yang dapat mengion menghasilkan proton.

Asam Amino Mempunyai Kurva Titrasi yang Khas Terdapat dua tahap yang nyata, masing-masing berhubungan dengan pelepasan satu proton. Tiap-tiap tahap menyerupai bentuk kurva titrasi asam monoprotik, seperti asam asetat dan dapat di analisis dengan cara yang sama. Pada awal titrasi alanin, bentuk yang dominan adalah +NH3-CHR-COOH, bentuk protonnya (di dalam rumus ini R melambangkan gugus metal dari alanin). Pada titik tengah tahap pertama titrasi, gugus karboksil alanin akan kehilangan proton, dan konsentrasi molar donor proton (+NH3-CHR-COOH) sama dengan konsentrasi molar akseptor proton (+NH3-CHR-COO-). Pada titik tengah titrasi, pH sama dengan pK dari gugus berproton yang sedang dititrasi. Karena titik tengah pH mencapai 2,34, gugus karboksil alanin mempunyai pK 2,34. Jika sekarang kita melanjutkan titrasi lebih jauh, kita akan memperoleh titik lain yang penting, yakni pada pH 6,02. Disini, terdapat titik belok, yang mencerminkan bahwa kita tel;ah menyelesaikan pembebasan proton yang pertama dan mulai melepaskan proton yang kedua. Pada pH ini, alanin terdapat, sebagian besar dalam bentuk ion dipolar +NH3-CHR-COO-. Tahap kedua titrasi berhubungan dengan pembebasan proton dari gugus
+

NH3 alanin. Pada titrik tengah, kita memperoleh konsentrasi molar yang sama

bagi +NH3-CHR-COO- dan NH2-CHR-COO-. pH pada titik ini adalah 9,69, sama dengan pK bagi gugus +NH3-. Titrasi sempurna terjadi pada pH kira-kira 12, pada saat ini, sebagian besar alanin berbentuk NH2-CHR-COO-.

Muatan Formal Muatan-muatan formal yang dijumlahkan seluruhnya, memberikan total keseluruhan muatan molekul atau ion. Muatan formal juga dapat menjelaskan kemungkinan tempat muatan dapat diketemukan dalam suatu molekul. Ingatlah bahwa muatan formal akan sama dengan :

Muatan Formal = (# electron valensi) (# ikatan) (# pasangan electron bebas) Sebagai contoh, perhatikan ion nitrit (NO2-) . Pertanyaan utama menyangkut lokasi secara tepat muatan-1 resminya berada. Keseluruhan ion membawa muatan formal pada atom-atom yang mana muatan ini resminya terletak? Untuk menemukan jawabannya, mulailah dengan menggambarkan diagram titik Lewis yang sebenarnya untuk NO2-. Ingatlah bahwa jumlah muatan formal pada atom-atom sama dengan keseluruhan muatan dari molekul (-1). Diagram ini juga mengungkapkan bahwa muatan -1 ditempatkan pada oksigen dengan satu ikatan. Sebenarnya nitritmempunyai diagram titik Lewis yang lain dan yang ekuivalen (struktur resonansi) tempat muatan -1 diletakkan pada atom oksigen yang lain.

V.

Alat dan Bahan Alat: 1. Pipet tetes 2. Gelas Kimia 3. Gelas ukur 4. Bunsen 5. Kawat kasa 6. Batang pengaduk 7. Penangas air 8. Statif 9. Klem 10. Buret 11. Erlenmeyer Bahan: 1. Indikator PP 2. Formalin 3. Larutan NaOH 4. Larutan HCl 5. Tripsin 6. Gelatin

VI.

Prosedur Menyiapkan 100 ml gelatin 5%. Mengatur temperature 38oC.

Menambahkan ke dalamnya 1 ml indikator PP dan 0,2M NaOH tetes demi tetes sampai tepat warna merah muda. Kemudian menambahkan tetes demi tetes 0,1M HCl sampai warna merah muda tadi hilang (pH = 8,0). Hati-hati jangan terlalu asam. Masukan gelatin yang telah di netralisir tadi ke dalam incubator 38oC. Pada 25ml larutan tripsin menambahkan beberapa tetes PP. Menambahkan tetes demi tetes 0,2M NaOH sampai warna merah muda. Kemudian menambahkan tetes demi tetes 0,1M HCl samapi warna tersebut tepat hilang (pH 8,0). Tepat pada jam nol menambahkan larutan tripsin tersebut ke dalam gelatin. Mengaduknya! Setelah tercampur rata, mengambil 10ml campuran, memasukkannya ke dalam 100ml beker gelas. Mendidihkannya untuk merusak enzim. Mencatat waktunya, dinginkan. Menambahkan 15ml formalin netral dan 3 tetes indikator PP. Pada interval 15 menit melakukan hal yang sama seperti di atas. Semua ini dilakukan duplo. Pada masing-masing hasil reaksi diatas (interval 0, 15, 30, 60, 90, dan 120 menit) melakukan titrasi dengan 0,02M NaOH dengan titik akhir warna merah muda.

VII.

Hasil Pengamatan Tabung 1 (Gelatin) Sebanyak 100 ml gelatin (kuning bening) ditambahkan dengan 1ml

phenolphthalein dan ditetesi dengan NaOH 0,2 M sebanyak 4ml, larutan gelatin berwarna merah muda. Lalu ditetesi dengan 16 tetes HCl 0,1M, larutan menjadi warna kuning bening.

Tabung II (Urine) Urine 100ml (kuning bening) ditambahkan dengan 1 ml PP dan ditetesi

dengan NaOH o,2 M sebanyak 3 ml. larutan urine berubah warna menjadi merah muda. Kemudian ditetesi dengan HCl 0,1 10 tetes, larutan menjadi kuning bening.

Tabung I (Gelatin) + Tabung II (urine)

10 ml campuran antara gelatin+urine ditambahkan 15ml formalin+ 3 tetes penolthaplein dan dititrasi dengan NaOH 0,02 M, larutan menjadi merah muda. Table interval waktu No Waktu t = 0 Tabung 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 V.NaOH (ml) 8,7 9,2 9 9,5 9,25 9,75 9,5 9,8 10 10,1 10,2 10,4 V.NaOH ratarata 8,95

t = 15

9.25

t = 30

9.5

t = 60

9.65

t = 90

10.05

t = 120

10.3

VIII.

Persamaan Reaksi Reaksi pada Inkubator O O O Tripsin 2 R CH- C NH2 OH Asam Amino - C N CH C N CH H R H R

Protein

Reaksi pemanasan untuk merusak enzim tripsin O H O R CH C R C- C NH2 OH NH3+ OAsam Amino Ion dipolar

Reaksi jika ditambahkan formalin H O RCC + 2CH2O NH3+ OIon dipolar Formalin H R C COOH HOH2C N CH2OH Metil diol

Reaksi Titrasi H O RCC ONa HOH2C N CH2OH Natrium metil diol

H R C COOH + NaOH HOH2C N CH2OH Metil diol Natrium hidroksida

IX.

Analisis Data X2 0 225 900 3600 8100 14400 27225 Y2 52,5625 66,4225 81,9025 88,36 94,09 100 483,3375

Waktu (X) t = 0 t = 15 t = 30 t = 60 t = 90 t = 120 =315

V.NaOH (Y) 7,25 8,15 9,05 9,4 9,7 10 53,55

XY 0 122,25 271,5 564 873 1200 3030,75

Slope

= = 0.0205263

Intersept =

= = 7,8473 10

Persamaan Garis Lurus

: y = bx+a y = 0.0205263x + 7,8473

X Y

0 7,8473

1 7,8678

2 7,8883

3 7,9088

4 7,9294

5 7,9499

Perhitungan mg N asam amino (Anggap 1 ml NaOH 0,1 N equivalen dengan 1,4 mg N asam amino) mg N asam amino = t 0 t 15 t 30 t 60 t 90 = = = = = = 10,15 mg = 11,41 mg =12,67 mg = 13,16 mg = 13,58 mg = 14 mg

t 120 =

X.

Pembahasan Percobaan titrasi formal ini bertujuan untuk mengetahui titik akhir titrasi

antara gugus karboksil dengan NaOH. Asam amino yang digunakan pada percobaan totrasi formal asam amino ini adalah gelatin dan tripsin. Karena pada prinsipnya titrasi formal ini adalah titrasi asama basa, maka formalin, tripsin, dan gelatin yang digunakan pada percobaan harus dinetralkan dulu supaya tidak mengganggu hasil percobaan nantinya. Kondisi bahan-bahan yang tidak netral akan merubah kebutuhan Natrium Hidroksida dalam mentitrasi sampel. Apabila hal itu terjadi, maka data yang diperoleh tidak valid karena tidak sesuai dengan yang seharusnya.

11

Setelah dinetralkan, selanjutnya larutan protein tersebut dimasukkan ke dalam incubator. Inkubasi larutan dilakukan pada suhu 38oC. Hal ini disesuaikan dengan kondisi optimum aktivitas enzim untuk bereaksi dengan substrat dalam menghasilkan asam amino (produk). Masing-masing asam amino tersebut ditambahkan indikator PP dan formalin. Penambahan ini bertujuan untuk membentuk dimentiol. Dengan adanya dimentiol ini berarti gugus amino dari asam amino tersebut terikat. Penambahan ini tidak akan mempengaruhi titrasi antara gugus karboksil dan NaOH. Terbentuknya dimentiol ini dapat menunjukkan titik akhir titrasi yang ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi merah muda. Pada percobaan ini juga dilakukan pemanasan. Pemanasan itu

dimaksudkan agar enzim yang terdapat

di dalam protein rusak. Penghentian

aktivitas enzim ini akan memberikan nilai/angka pasti terhadap produk yang dihasilkan, sehingga jumlah asam amino yang terbentuk tepat dan tidak bertambah lagi ketika proses titrasi berlangsung dan dapat diperhitungkan dengan benar. Gugus asam amino produk yang dihasilkan oleh reaksi enzimatik antara tripsin dan gelatin pada larutan sampel yang dititrasi oleh Natrium Hidroksida adalah gugus NH3+ yang bersifat asam, oleh karena ini titrasi ini pada prinsipnya dikatakan tritrasi asam basa. Kurva kebutuhan Natrium Hidoksida yang dibutuhkan untuk menetralkan gugus NH3+ pada titrasi formol ini dibandingkan dengan waktu/lama masa inkubasi menunjukkan garis yang terus naik dan kemudian menjadi hampir datar. Ini menunjukkan bahwa pada masa inkubasi yang paling lama tersebut, jumlah substrat sudah habis bereaksi dengan enzimnya. Sehingga produk asam amino pada larutan memberikan konsentrasi yang konstan/tetap. Laju pembentukan asam amino yang paling cepat terjadi pada kisaran 0-15 menit dari awal. Hal ini mungkin saja terjadi karena kuantitas asam amino yang ada pada saat itu masih cukup banyak dan kondisi aktivitas enzimatik yang sangat optimal sehingga laju nya paling cepat.

12

XI.

Kesimpulan 1. Titrasi formal ini bertujuan untuk mengetahui titik akhir titrasi antara gugus karboksil dengan NaOH. 2. Prinsipnya titrasi formol ini adalah titrasi asama basa.

3. Pemanasan sampel larutan setelah masa inkubasi dimaksudkan untuk menghentikan aktivitas enzim sehingga tidak lagi bereaksi dengan substrat. 4. Lama waktu kontak antara enzim dan substrat mempengaruhi jumlah asam amino yang dihasilkan selagi substrat masih tersedia.

XII. Andi.

Daftar Pustaka 2010. Titrasi Formol Asam Amino, (Online),

(http://andiscientist.blogspot.com/2010/08/titrasi-formol-asam-amino.html, diakses tanggal 12 April 2012). Lehninger, 1982. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : Erlangga Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI.

13

XIII.

Gambar Alat

Pipet Tetes

Erlenmeyer

Beker gelas

Batang pengaduk

Gelas Ukur

Buret

14

Penangas Air Bunsen spiritus

15

XIV.

Jawaban Pertanyaan

Pertanyaan: 1. Buatlah kurva titrasi antara volum alkali (ordinat) terhadap waktu (absis) 2. Buat kurva antara mg nitrogen asam amino (ordinat) terhadap waktu (absis) 3. Mengapa harus ditambahkan alkali pada formalin sampai merah muda dan phenoltaflein? 4. Apa tujuan dilakukan titrasi formal ini? Jawaban: 1. Kurva 1. Kurva volum titrasi NaOH terhadap waktu
12 10 volume NaOH 8 6 4 2 0 0 20 40 60 waktu 80 100 120 140

16

2. Kurva 2. Kurva mg N asam amino terhadap waktu

16 14 12 mg N asam amino 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 Waktu 80 100 120 140

Kurva y = 0.0205263x + 7,8473

7.96 7.94 7.92 7.9 7.88 7.86 7.84 0 1 2 3 4 5 6

3. Karena dengan ditambahkan alkali pada formalin maka akan terbentuk dimethiol dan dengan terbentuknya dimethiol ini berarti gugus anionnya sedah terikat, sehingga tidak mempengaruhi reaksi antara asam dengan

17

basa (NaOH) dan titik titrasi dapat ditentukkan dengan tepat. Penambahan pp berguna untuk menunjukkan titik akhir titrasi dengan perubahan warna.

4.

Untuk mengetahui titik akhir titrasi antara gugus karboksil dengan NaOH.

18