MEKANISME MIKROBA PADA KONDISI ANAEROB Mikroorganisme anaerob dibagi menjadi 2 golongan yaitu golongan anaerob obligat dan

anerob fakultatif. Golongan anaerob fakultatif merupakan Organisme yang dapat menggunakan oksigen sebagai akseptor elektron atau sebagai penggantinya dapat diambil oksigen dari garam-garam seperti NaNO3, Na2SO4 atau karbonat. Sedangkan, golongan anaerob obligat adalah organisme yang tidak membutuhkan oksigen bebas bahkan jika kontak dengan oksigen akan mengakibatkan penghambatan atau mematikan organisme tersebut. Mikroba anaerob obligat tidak dapat bertahan hidup jika kontak langsung dengan oksigen minimal selama 10 menit. Ketidaktahanan mikroba anaerob obligat terhadap oksigen disebabkan tidak adanya enzim superoksida dismutase dan katalase, yang akan mengubah superoksida yang terbentuk dalam sel mereka karena adanya oksigen.. Mikroba anaerob obligat dapat hidup melalui proses fermentasi, respirasi anaerob, atau proses methanogenesis. Mikroba anaerob obligat yang sensitif terhadap oksigen memperoleh energi dan melakukan metabolisme dengan menggunakan beberapa alternatif akseptor elektron untuk respirasi seluler seperti sulfat , nitrat , besi , mangan , merkuri , dan karbon monoksida. Ada beberapa hipotesis mengenai anaerob obligat yang sensitif terhadap oksigen: 1. Oksigen terlarut akan meningkatkan potensial redoks dari larutan. Potensial redoks tinggi menghambat pertumbuhan beberapa bakteri anaerob obligat Sebagai contoh, methanogen tumbuh pada potensial redoks lebih rendah dari -0,3 V. 2. Sulfida merupakan komponen penting dari beberapa enzim. Molekul oksigen mengoksidasi sulfida untuk membentuk disulfida, sehingga menonaktifkan enzim tertentu. Mikrooorganisme ini tidak dapat tumbuh tanpa enzim yang dinonaktifkan tersebut. 3. Terhambatnya pertumbuhan mikroba anaerob obligat akibat kurangnya keseimbangan dalam biosintesis, karena elektron yang akan digunakan untuk biosintesa habis untuk mengurangi oksigen. (Kim and Geoffrey, 2008) Gambar 1. Kondisi Pertumbuhan Mikroba secara Aerob dan Anaerobik dalam Kultur Cair

Respon suatu organisme terhadap O2 di lingkungannya tergantung pada terjadinya distribusi berbagai enzim yang bereaksi dengan radikal oksigen (O2-) yang selalu dihasilkan oleh sel-sel saat dihadapkan dengan O2. Semua sel mengandung enzim yang mampu bereaksi dengan O2. Misalnya, oksidasi dari flavoprotein oleh O2 yang selalu menghasilkan pembentukan H202 (peroksida) sebagai salah satu produk utama dan sejumlah kecil superoksida bebas yang bahkan lebih toksik berupa radikal oksigen (O2-). Selain itu, pigmen klorofil dalam sel dapat bereaksi dengan O2 dengan bantuan cahaya dan menghasilkan singlet oxygen, bentuk lain radikal oksigen yang merupakan oksidator kuat. Semua organisme yang dapat hidup di lingkungan O2, memiliki enzim superoksida dismutase yang dihasilkan oleh sistem metabolisme. Selain itu, organisme ini juga mempunyai enzim katalase, yang menguraikan H2O2. Bakteri aerotolerant (seperti bakteri asam laktat) tidak memiliki enzim katalase, sehingga mikroba ini menguraikan H2O2 menggunakan enzim peroksidase yang berasal dari elektron NADH2 sehingga dapat mengubah peroksida menjadi H2O. Beberapa organisme fotosintesis dilindungi dari reaksi oksidasi oleh radikal oksigen dengan adanya pigmen karotenoid. Pigmen karotenoid secara fisik bereaksi dengan radikal oksigen sehingga dapat mengurangi tingkat keracunan di dalam sel. Organisme anaerob obligat tidak memiliki enzim superoksida dismutase, katalase atau peroksidase. Oleh karena itu, organisme ini mengalami oksidasi oleh radikal oksigen sehingga dapat mematikannya saat berada di lingkungan dengan kandungan O2. Berikut ini merupakan reaksi enzim superoksida dismutase, katalase dan peroksidase yang digunakan untuk detoksifikasi radikal oksigen :

(Todar, 2000) Contoh Petumbuhan Mikroba Anaerob Obligat pada Berbagai Media Medium Thioglycollate 1. 1. Keterbatasan Medium Thioglycollate

Banyak organisme (termasuk banyak chemoheterotrophs) tidak dapat tumbuh dalam media ini.

Tidak dapat digunakan metode lain yang ditambahkan untuk pertumbuhan anaerob: (1) Akseptor elektron alternatif (seperti nitrat) atau (2) Dalam keadaan terang (seperti apa yang dilihat dengan bakteri fotosintesis anoxygenic). Jadi, suatu organisme anaerob obligat merupakan organism yang tidak bisa mentolerir oksigen dan hanya dapat memperoleh energi dengan reaksi yang tidak melibatkan O2
-

. Dalam tes ini,pertumbuhan anaerobik terjadi jika mampu melakukan fermentasi dari

glukosa dalam media.

Hasil yang ditunjukkan pada medium Thioglycollate bisa sulit untuk dibaca. Apabila sulit untuk dibaca dapat digunakan kombinasi dengan metode lain yang dapat digunakan untuk mengoreksi yaitu: (1) pengujian untuk fermentasi menggunakan Fermentasi Glukosa Broth, (2) melakukan uji katalase, dan (3) menguji apakah organisme dapat tumbuh dengan adanya oksigen.

Hasil Pertumbuhan Mikroba pada Medium Thioglycollate

1. No. Tabung Golongan berdasarkan toleransi oksigen Respirasi aerobik Fermentasi Kemampuan toleransi oksigen Kemampuan tumbuh tanpa oksigen Reaksi katalase Reaksi pada Glucose O/F Medium Respon untuk sodium azida dalam media pertumbuhan (Lindquist, 2001) Medium Pepton+Agar 1 Obligat Aerob + + + O or 2 Fakultatif anaerob + + + + + F Sensitif (di bawah kondisi aerobik) Resisten 3 Aerotoleran Anaerob + + + 4 Obligat Anaerob + + -

Sensitif

Resisten

1. Keterangan :

Tabung 1: media yang mengandung pepton dan agar dan ditambah nutrisi lain yang biasa digunakan bakteri untuk metabolisme dan replikasi kecuali bahan yang akan mendukung pertumbuhan anaerobik seperti glukosa (atau sesuatu yang lain yang bisa difermentasi) atau nitrat (atau akseptor elektron lain / akseptor pengganti oksigen yang dapat digunakan dalam respirasi anaerob). Setelah inokulasi media ini dan inkubasi dalam gelap, pertumbuhan apapun akan terjadi karena respirasi aerobik dengan pertumbuhan hanya di bagian atas media.

Tabung 2: media yang sama seperti pada tabung 1, namun telah ditambahkan glukosa. Setelah inkubasi (dalam gelap), setiap pertumbuhan anaerob akan terjadi fermentasi glukosa. Dengan demikian media dapat digunakan untuk mendeteksi apakah organismetersebut aerobik atau fermentasi.

Tabung 3 : media yang sama seperti pada tabung 1, namun telah ditambahkan kalium nitrat. Setelah inkubasi (dalam gelap), setiap pertumbuhan anaerob terjadi respirasi anaerob dimana organisme menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron. Kita dapat melakukan pengujian dalam media broth pengurangan nitrat; dengan reagen dapat dideteksi pembentukan nitrit, dan dengan tabung Durham kita dapat dideteksi pembentukan gas N 2.

Tabung 4 : media yang sama seperti pada tabung 1, namun tabung telah diinkubasi dengan cahaya. Dengan cahaya sebagai sumber energi utama, pertumbuhan anaerob terjadi karena phototrophy anoxygenic.

(Lindquist, 2001) Media Anaerobic Brucella Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA)

Media PEA berisi phenylethylalcohol menghambat pertumbuhan gram negatif, bakteri anaerob-fakultatif dan mencegah mikroba berkerumun. PEA akan mendukung pertumbuhan bakteri anaerob obligat, baik gram positif dan gram negatif . Media ini disiapkan, disimpan dan ditiadakan dalam kondisi oksigen bebas untuk mencegah pembentukan produk teroksidasi sebelum digunakan.

Komposisi media
o o o o o o o o o

Pankreas hasil perombakan Kasein 10,0 g Pepton Kedelai 3,0 g Animal Tissue 10,0 g Dekstrosa 1,0 g Ekstrak Yeast 2,0 g Natrium Klorida 5,0 g Natrium bisulfit 0,1 g Hemin (0,1 %) 5,0 ml Vitamin K(1 %) 1,0 ml

L -Sistin 0,4 g Agar 15,0 g Darah Domba 45,5 ml Phenylethyl Alkohol 2,7 ml Distilasi Air 1.000,0 ml

Penyimpanan: Setelah dibuat, simpan pada suhu kamar (13 C 27 C) dalam wadah tertutup samapai digunakan. Hindari terlalu panas atau beku. Jangan gunakan media jika ada tanda-tanda kerusakan (menyusut, retak atau perubahan warna) atau kontaminasi.

Metode : Inokulasi dilakukan pada kondisi anaerobik dan diinkubasi pada 35-37 o C selama 18-48 jam.

Contoh Mikroba Anaerob Obligat

Bacteroides

Banyak terdapat pada organ intestinal ikan segar yang ditumbuhkan pada EG-fildes agar dengan buffer H2CO3-CO2 dan disimpan pada suhu 4C. Saat diinokulasikan pada plate diinkubasi pada suhu 30C selama 1-3 hari dengan kondisi lingkungan 100% CO2. Kultur media yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba anaerob obligat adalah peptone-yeastfildes-glucose (PYFG) broth. Medium ini disterilisasi dalam autoclave 115C selama 20 menit. Sebelum digunakan untuk tempat pertumbuhan mikroba anaerob obligat media yang telah cair dimasukkan dalam wadah yang mengandung 90%N2-10%CO2 dan telah dibiarkan selama 10-14 hari. Karakteristik Bacteroides antara lain non-motil, non-sporing, gram negative, berbentuk batang , obligat anaerob dan memproduksi asam asetat yang merupakan sebagian besar produk yang dihasilkan pada media PYFG Broth. Dalam organ instestinal ikan segar terdapat 2 spesies Bacteroides yang tumbuh yaitu:

B. hypermegas : positif terjadi aktivitas reduksi nitrat dan dekarboksilasi asam glutamate, produksi hydrogen sulfide dan berbagai gas dari glukosa, dan dapat memfermentasi arabinosa, xylosa, ribose, galaktosa, maltose, laktosa, amnnitol dan sorbitol.

B.fragilis : di dalam komponen bile memproduksi asam asetat dan sam suksinat, positif ativitas reduksi nitrat, dapat memfermentasi karbohidrat, dan pH media PYFG/ akhir 5,5-6,0.

(Sakata, et.al. 1981)

Clostridia

Semua spesies golongan bakteri Clostridia asal rumen akan mati jika berada pada kondisi aerob. Beberapa spesies Clostridia memiliki enzim katalase yang sangat sedikit bahkan ada yang tidak punya sama sekali dan mikroorganisme ini tidak sedikitpun memiliki enzim superoksida dismutase. Oleh karena itu, spesies golongan Clostridia termasuk mikroba anaerob obligat dimana tidak memiliki perlindungan terhadap radikal oksigen bebas yang dapat mematikan sel itu sendiri. (McCord, J.M, Bernard B.K, and Irwin Fridovich,1971). Clostridium sp. sebagai mikroba anaerob obligat dapat dimanfaatkam untuk menghasilkan biohydrogen. Mikroorganisme natural anaerobic ini dengan menggunakan metode heat-shocked sehingga Clostridia yang bergermninasi dapat mengkonversi limbah padat dan cair organik menjadi gas hydrogen. Produksi hidrogen berhenti ketika propionate di dalam kulur dikonsumsi dan etanol, asetat serta butirat tersisa dalam reaktor. Fenomena ini diharapkan karena produksi hidrogen diperlukan untuk produksi alkohol jika tekanan parsial hidrogen positif dipertahankan (Lay et al, 1999.). Alkohol adalah pruduk utama dalam metabolisme fermentasi hidrogen Clostridium sp yang memproduksi hidrogen serta akan terbentuk asam volatil selama fase pertumbuhan eksponensial. Produksi hydrogen stabil pada substrat yang mengandung sukrosa 4,0o,5 g/l dan pH 5,40,2 (Fan et.al., 2004). Karakteristik bakteri Clostridium antara lain berbentuk batang, anaerob obligat, besar, gram positif, dapat merusak protein atau membentuk toksin, spora klostridia biasanya lebih besar daripada diameter batang tempat spora dibentuk dan sebagian besar bergerak karena mempunyai flagel peritrikus. Habitat alamiah di tanah atau saluran usus hewan dan manusia sebagai saprofit. Koloni besar dan meninggi dengan pinggir utuh dan sebagian besar menghasilkan hemolisis pada blood agar. Spora sangat resisten terhadap panas dan tahan pada suhu 100C selama 3-5 jam, tetapi daya tahan ini berkurang pada pH asam atau konsentrasi garam tinggi (Edward,2009). Gambar Clostridium pada Blood Agar

DAFTAR PUSTAKA Anonymous.2009. Media Anaerobic Brucella Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA) http://www.anaerobesystems.com. Concord Circle Morgan Hill. Diakses tanggal 11 November 2010. Edward, Rob. 2009. Clostridium. http://www.textbookofbacteriology.net/clostridia.html. Diakses 13 November 2010. Fan et.al. 2004. Optimization of Initial Substrate and pH Levels or Germination of Sporing Hydrogen 2010. Kim, Byung Hong and Geoffrey Michael Gadd. 2008. Bacterial Physiology and Metabolism. Cambridge University Press. Cambridge. UK. Lay,J.J.,Lee,Y.J.,Noike,T.,1999.Feasibility of Biological Hydrogen Production from Organic Fraction of Municipal Solid Waste.WateRes.33,25762586. Lindquist, John. 2001. Differential Media : Oxygen Relationships and the Use of Producing Anaerobes in Cow Dung Compost. http://umgapa.podzone.org/Taras/SciFair/2004-2005/pH55.pdf. Diakses tanggal 13 November

Thioglycollate Medium. http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfthiognf.html. Department of Bacteriology,University of Wisconsin Madison. Diakses tanggal 11 November 2010. McCord, J.M, Bernard B.K, and Irwin Fridovich.1971. An Enzyme-Based Theory of Obligate Anaerobiosis:The Physiological Function of Superoxide Dismutase.

http://www.pnas.org/content/68/5/1024.full.pdf. Diakases tanggal 13 November 2010 Sakata, et.al. 1981. Characteristics of Obligate Anaerobic Bacteria in the Intestines of Freshwater Fish. http://rms1.agsearch.agropedia.affrc.go.jp/contents/JASI/pdf/society/22-4938.pdf.. Diakses tanggal 11 November 2010 Todar, Kenneth. 2000. Phycial and Environmental Requirements for Growth. University of Wisconins. Madison.